据JournalofHepato-Biliary-PancreaticSciences年2月报道。题：MANFProtectsPancreaticAcinarCellsAgainstAlcohol-inducedEndoplasmicReticulumStressandCellularinjury.作者：HuaxunWu等。

背景

长期以来，饮酒一直被认为是急性胰腺炎和慢性胰腺炎发病的危险因素之一。胰腺炎是一种以腺泡细胞损伤和死亡为特征的炎症性疾病，流行病学研究表明，胰腺炎的发病风险与饮酒量或饮酒持续时间呈显著正相关。然而，只有一小部分重度饮酒者会发生胰腺炎，这表明胰腺炎发病可能需要其他危险因素的共同作用，或者摄入酒精引起的机体适应性反应可能保护胰腺免受酒精的毒性作用。因此，明确酒精性胰腺炎的细胞和分子机制至关重要。

腺泡细胞是外分泌胰腺的功能单位，可以合成和分泌多种消化酶，其丰富的内质网(ER)网络可调控蛋白的合成、折叠、修饰和运输。在生理和病理因素的损伤作用下，腺泡细胞可能无法正确折叠和修饰内质网中的蛋白质，进而导致内质网应激，并触发一种高度保守的适应性反应，称为未折叠蛋白反应(UPR)。胰腺腺泡细胞高度依赖内质网功能，所以其对内质网应激极其敏感。内质网应激诱导的UPR信号通路已在胰腺炎中得到证实，其可能起到减轻应激反应和恢复内质网稳态的作用；然而内质网应激持续存在会导致胰腺发生病理性改变和腺泡细胞损伤。

中脑星形细胞来源的神经营养因子(MANF)是一种内质网应激诱导蛋白，最初被认为是脑多巴胺能神经元的生长促进因子，现已证实在体内外多种类型的细胞中，MANF对内质网应激引起的细胞损伤均具有保护性作用。研究表明，小鼠胰腺特异性MANF缺失会引起内质网应激，引发胰腺β细胞凋亡和糖尿病，而重组MANF蛋白可促进胰腺细胞的增殖；此外，MANF还可保护人胰岛β细胞免受实验性应激引起的细胞死亡。然而，MANF在胰腺腺泡细胞中的作用和酒精的作用尚不清楚。

在本研究中，我们使用小鼠-6胰腺腺泡细胞系，在体外研究酒精诱导的腺泡细胞损伤，旨在阐明酒精暴露是否会导致内质网应激和细胞损伤，并进一步研究MANF在酒精诱导的内质网应激和细胞死亡中的作用。

方法

1.给药方式

用含0.2%、0.4%或0.8%(v/v)酒精的完全培养基孵育-6胰腺腺泡细胞系24h、48h、72h。在加入酒精前2小时，培养基中加入10ng/ml重组人MANF蛋白。

2.腺病毒感染(AD-MANF)

将编码小鼠MANF的DNA序列插入pAdenoG-HA载体并包装成腺病毒(Cat.NoA)。空载体病毒和AD载体(Cat.NoA,ABM)作为对照。两种腺病毒滴度均在1xpfu/ml以上，并通过转导HEK细胞扩增。用AD-MANF或AD空载体感染细胞48小时，使-6细胞中MANF过表达。

结果

1.酒精引起内质网应激并抑制-6胰腺腺泡细胞的细胞活力

-6细胞在含0.2%、0.4%和0.8%酒精的培养基中分别孵育24h、48h和72h，结果表明，在0.4%和0.8%酒精中孵育24h，或在0.2%酒精中孵育48h均会显著降低细胞活力(图1A)；而在0.4%酒精中孵育24h会导致胰腺腺泡细胞的凋亡(图1B)。为了研究酒精对内质网应激的作用，-6细胞分别在0.2%、0.4%或0.8%酒精中孵育12h，结果表明，0.4%和0.8%酒精会促进内质网应激标志物的表达(图1C)。我们进一步研究了酒精对内质网应激的时间依赖性作用，图1D结果表明，0.4%酒精孵育6h可上调各种内质网应激标志物的表达，包括GRP78、p-perk、ATF6、p-IRE1α、xbp-1s、p-eIF2a和caspase12；酒精也可促进凋亡标志物cleaved-caspase3的表达。基于以上结果，后续实验继续使用0.4%酒精处理细胞。

图1酒精对胰腺腺泡细胞活力及内质网应激的影响。(A)MTT法测定-6细胞在不同浓度酒精(0.2%、0.4%、0.8%)和不同孵育时间下的细胞活力。数据表示为均值±标准误；n=6；与0h相比，*P0.05，**P0.01。(B)流式细胞术测定酒精(0.4%)对细胞凋亡的影响。n=3；与对照组相比，##P0.01。(C)免疫印迹法检测不同浓度酒精(0.2%，0.4%，0.8%)对内质网应激标志物表达的影响。n=3；与对照组相比，#P0.05。(D)免疫印迹法测定酒精(0.4%)对内质网应激标记物的时间依赖性作用。n=3；与0h相比，#P0.05。

2.抑制氧化应激和内质网应激保护酒精性细胞损伤

大量证据表明内质网应激和氧化应激之间存在相互作用。氧化应激可能在酒精性胰腺损伤中发挥作用，因此，我们研究了酒精对-6细胞氧化应激的影响。4-羟基壬烯醛(4-HNE)和2,4-二硝基酚(DNP)是敏感可靠的氧化应激指标，酒精可时间依赖性地上调-6腺泡细胞中4-HNE和DNP的表达(图2A)。

为了证实内质网应激和氧化应激是否与酒精性细胞损伤有关，我们使用特异性抑制剂和抗氧化剂抑制酒精性内质网应激和氧化应激。4-PBA，STF和salubrinal是常用的内质网应激抑制剂；其中，4-PBA可在体内外促进蛋白质的折叠和减少内质网应激；STF是一种新型的IRE1小分子抑制剂；Salubrinal可选择性抑制eIF2α去磷酸化，并已被证明能够抑制内质网应激介导的细胞凋亡。NAC是一种含硫醇的抗氧化剂和强效自由基清除剂。结果表明，4-PBA(5mM)、STF(10μM)、salubrinal(10μM)和NAC(1mM)对腺泡细胞活性无显著影响(图2B)。NAC可抑制酒精诱导的p-perk、ATF6、p-IRE1α和4-HNE的表达(图2C)，表明酒精诱导的氧化应激和内质网应激之间存在相互作用。4-PBA(5mM)、STF(10μM)、salubrinal(10μM)和NAC(1mM)预处理可显著保护酒精性腺泡细胞损伤(图2D)。同时，4-PBA(5mM)、STF(10μM)或salubrinal(10μM)与NAC(1mM)联合应用的保护效果略优于单独应用4-PBA、STF或salubrinal。值得注意的是，salubrinal与NAC联合应用的保护作用显著优于单独应用salubrinal；但NAC与内质网应激抑制剂(4-PBA或STF)联合应用的保护效果与单独应用内质网应激抑制剂无显著差异。(图2D)。

图2抑制氧化应激和内质网应激对酒精性细胞凋亡的影响。(A)DNP和4-HNE的免疫印迹分析。n=3；(B)应用内质网应激抑制剂4-PBA(5mM)、STF(10μM)、salubrinal(10μM)和抗氧化剂NAC(1mM)分别处理-6细胞24h，MTT法测定内质网应激抑制剂和抗氧化剂NAC对细胞活力的影响。n=6；与对照组相比，##P0.01；与酒精组相比，*P0.05。(C)应用NAC（1mM）处理-6细胞12h。免疫印迹法检测NAC对内质网应激标志物的影响。n=3；与对照组相比，#P0.05，与酒精组相比，*P0.05。(D)内质网应激抑制剂4-PBA(5mM)、STF(10μM)、salubrinal(10μM)与NAC(1mM)联合应用或单独应用处理-6细胞24h,MTT法检测细胞活力。n=6；与对照组相比，##P0.01；与酒精组相比，*P0.05；与单独用药相比，?P0.05。

3.外源性MANF通过抑制IRE1-caspase12-caspase3凋亡通路减轻酒精诱导的-6细胞凋亡

MANF是一种内质网应激诱导蛋白。为了明确MANF在酒精性腺泡细胞损伤中的作用，我们首先测定酒精对MANF表达的影响，结果表明，酒精处理后MANF的表达逐渐升高，12h时差异具有统计学意义(图3A)。为了明确MANF是否保护酒精性腺泡细胞损伤，我们应用外源性重组人MANF(10ng/ml)处理细胞，结果表明，MANF可显著缓解酒精诱导的细胞活性下降(图3B)和细胞凋亡(图3C)。为了明确外源性MANF对内质网应激的影响，我们进一步测定了酒精和MANF对内质网应激标志物表达的影响，结果显示MANF显著抑制酒精激活的p-IRE1α-caspase12-caspase3通路(图3D)。上述结果表明，MANF可能通过抑制p-IRE1/caspase12/caspase3凋亡通路来减轻酒精的细胞毒性。

图3外源性MANF对酒精性细胞损伤和内质网应激的影响。(A)免疫印迹法测定酒精对MANF表达的影响。n=3；(B)酒精分别处理24h和48h后，MTT法测定外源性MANF(10ng/ml)对细胞活力的影响。n=6；与对照组相比，##P0.01；与酒精组相比，*P0.05。(C)用酒精或酒精联合MANF(10ng/ml)处理细胞24h后，流式细胞术测定外源性MANF对细胞凋亡的影响。n=3；与对照组相比，##P0.01；与酒精组相比，*P0.05。(D)用酒精或酒精联合MANF(10ng/ml)处理细胞12h后，免疫印迹法测定酒精和外源性MANF对内质网应激标志物表达的影响。n=3；与对照组相比，#P0.05；与酒精组相比，*P0.05。

4.MANF过表达可保护胰腺腺泡细胞免受酒精诱导的凋亡

为了明确MANF对酒精性细胞损伤的保护作用，我们用AD空载体(对照组)和AD-MANF(小鼠MANF过表达)转染-6细胞，结果显示MANF过表达显著缓解了酒精诱导的细胞活力下降(图4A)和细胞凋亡(图4B)。进一步研究表明，MANF过表达显著抑制酒精激活的p-IRE1a/caspase12/caspase3通路(图4C)。

图4MANF过表达对酒精性细胞损伤和内质网应激的影响。(A)AD空载体或AD-MANF转染-6细胞，然后酒精处理24h。MTT法测定细胞活力。n=6；与无酒精对照组相比，##P0.01；与AD空载体+酒精相比，*P0.05。(B)AD空载体或AD-MANF转染细胞，然后酒精处理24h。流式细胞术测定细胞凋亡；n=3；与无乙醇对照组相比，##P0.01；与AD空载体+酒精相比，*P0.05。(C)用AD空载体或AD-MANF感染细胞，然后乙醇处理12h。免疫印迹法检测IRE1a、caspase12和cleavedcaspase3的表达。HAtag和MANF的表达是MANF转染成功的标志。n=3；与无酒精对照组相比，#P0.05。

5.siRNA敲低MANF表达增加IRE1a/caspase12/caspase3通路对酒精的易感性

为了进一步明确MANF在酒精性细胞损伤中的作用，我们用对照siRNA和MANFsiRNA转染-6细胞。结果表明，MANFsiRNA显著促进酒精性细胞死亡(图5B和5C)。进一步研究表明，MANFsiRNA显著促进酒精诱导的p-IRE1α/caspase12/cleaved-caspase3的激活(图5D)。此外，免疫荧光结果表明，MANFsiRNA可上调酒精诱导的caspase-12的表达(图5E)。以上结果表明，siRNA沉默MANF表达显著增加了IRE1a/caspase12/caspase3通路对酒精的易感性。

图5MANFsiRNA对酒精性细胞损伤和内质网应激的影响。(A)用对照siRNA或MANFsiRNA转染-6细胞，然后酒精处理24h。免疫荧光法测定MANF的表达。(B)用对照siRNA或MANFsiRNA转染细胞，然后酒精处理24h。MTT法测定细胞活力。n=6；与无乙醇对照组相比，##P0.01，与对照siRNA+酒精相比，*P0.05。(C)用对照siRNA和MANFsiRNA转染细胞，然后酒精处理24h。流式细胞术测定细胞凋亡；n=3;与无酒精对照组相比，##P0.01；与siRNA+酒精对照组相比，*P0.05。(D)用对照siRNA或MANFsiRNA转染细胞，然后酒精处理12h。免疫印迹法测定IRE1a、Caspase12、cleavedcaspase3和MANF的表达。与无乙醇对照组相比，#P0.05；与对照siRNA+酒精相比，*P0.05，**P0.01。(E)免疫荧光法测定MANFsiRNA和酒精对caspase12表达的影响。

讨论

本研究通过腺泡细胞体外实验探究酒精性细胞损伤和MANF的作用，结果表明酒精可引起剂量依赖性的细胞损伤。进一步的研究表明0.4%酒精可引起细胞凋亡，caspase3的活化和内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6、caspase12和IRE1α的表达上调。Caspase12是内质网特异性促凋亡蛋白，酒精促进caspase12的表达提示细胞死亡可能是由内质网应激相关的凋亡机制介导的。体内外研究表明酒精暴露可在多种细胞中引起内质网应激和细胞死亡。

MANF可能通过减轻内质网应激来发挥保护作用。ATF6，IRE1和PERK是三种主要的内质网应激相关蛋白，广泛参与内质网应激相关疾病的发生发展。ATF6和PERK是调节细胞凋亡的重要蛋白，而IRE1α是引起细胞凋亡的关键蛋白。本研究结果表明酒精可促进ATF6，IRE1α和PERK的表达(图1D)，而外源性重组人MANF可降低IRE1a的表达(图3D)。外源性MANF给药也减轻了酒精诱导的caspase-12和caspase-3的表达，同样，腺病毒过表达MANF也可抑制酒精诱导的IRE1α/caspase12/caspase3级联反应(图4C)；siRNA敲低MANF表达则加重酒精性细胞损伤和IRE1α/caspase12/caspase3级联反应(图5)。综上所述，本研究结果表明MANF通过抑制IRE1α/caspase12/caspase3通路来保护细胞免受酒精性细胞损伤。

结论

综上所述，本研究表明MANF是UPR的重要组成部分，其可能通过抑制IRE1a/caspase12/caspase3通路来减轻酒精性腺泡细胞损伤，进而发挥保护性作用。这一发现对酒精性胰腺炎的治疗具有积极的临床意义，通过构建MANF过表达的动物模型并开展进一步研究将有望发掘MANF潜在的治疗价值。